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實驗筆記丨免疫組織化學染色（IHC）步驟詳解

來源：時間：2022-11-02 15:34:07 瀏覽：5311次

免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)）。

包埋組織

在４％多聚甲醛溶液中固定組織48小時后，放入一次性組織包埋盒中脫水，浸蠟后包埋。

修片

修剪石蠟切片，直至將石蠟切片修到大部分組織在切面上。

組化

3.1 蠟塊制備

將組織蠟塊提前泡到冰水混合物中使其變軟，將組織蠟塊放在切片機上切出５微米的切片，60°Ｃ烘片１小時。

3.2 脫蠟

１）將切片放到60°Ｃ烘箱中烘片４ｈ以上。

２）在二甲苯I里置入片子，持續(xù)0.5 h，再置于二甲苯II，依然持續(xù)0.5 h。

3.3 水化

１）通過酒精，浸泡切片，酒精濃度不一，分為７０％、８０％、９０％、９５％、１００％，各濃度浸泡時間也有所差異，前３個濃度都是各自浸泡２分鐘，后面兩個濃度分別浸泡5分鐘、10分鐘。

２）最后將片子放到雙蒸水中浸泡２min。

3.4 組化

１）封閉處理：選擇內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，處理時間為20 min。

２）用雙蒸水浸泡三次，單次時間5 min。

３）抗原修復：準備pH＝6.0的10 nM檸檬酸抗原修復液400-600 ml，把片子放到里面，用保鮮膜封住燒杯口防止沸騰溢出。之后放到微波爐中用高火加熱10 min。

４）加熱后用雙蒸水補齊液面，在微波爐中加熱40 min（中低火至解凍之間），每隔10 min用雙蒸水補齊液面。

５）修復結(jié)束后，放到室溫下，使其自然冷卻。

６）DDW清洗180＂之后，通過PBS清洗，３分鐘／次，進行三次。

７）通過一抗封閉，保持４°Ｃ，第二天進行溫度回升，為37°Ｃ，然后通過PBS清洗，持續(xù)５分鐘。

８）在其中添加反應增強液，然后孵育，室溫條件，持續(xù)20 min，再通過PBS清洗，３分鐘／次，進行三次。

９）加入增強酶標山羊抗小鼠／兔IgG聚合物，然后孵育，室溫條件，持續(xù)20 min，再通過PBS清洗，3分鐘／次，進行三次。

1０）滴加DAB顯色液（現(xiàn)用現(xiàn)配、比例1:19），室溫孵育2-10 min（根據(jù)不同的抗體自行選擇染色時間）。用自來水輕輕沖洗掉。

１１）復染：加蘇木精染色50 s。用DDW，3 min，PBS，５min X３次。

１２）脫水：將片子依次浸泡到不同濃度的酒精梯度中：７０％，ｌｍｉｎ—８０％，ｌｍｉｎ—９０％，1 ｍｉｎ—９５％Ｉ，５ｍｉｎ—９５％ II ，５ｍｉｎ—１００％Ｉ，５ｍｉｎ—１００％ II，５ｍｉｎ。

１３）透明：利用二甲苯Ｉ、二甲苯 II 進行處理，每次處理持續(xù)20 min。

１４）中性樹脂封片，中性樹脂，加蓋玻片(組織部位切勿殘留小氣泡)，自然晾干。

來源：科研日精進

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